La microscopie confocale

Introduction

La compréhension des phénomènes biologiques implique la recherche de moyens d’observations toujours plus précis et tenant compte de la répartition des éléments dans les trois dimensions de l’espace. Cependant en microscopie classique, on ne peut se contenter que du seul plan de coupes de l’objet biologique que l’on étudie.

Ainsi des objets aux formes compliquées se trouvant dans des cellules vivantes (les mitochondries par exemple) apparaissent en coupe comme de simples sphères ou ellipsoïdes alors que si on regarde l’ensemble des coupes de l’objet, on peut constater que la structure est beaucoup plus complexe.

Seulement il est souvent long et compliqué de réaliser manuellement le nombre de coupes nécessaires à la visualisation de l’objet dans ses trois dimensions.

Afin de s’affranchir de ces problèmes techniques on utilise un type de microscope particulier dit confocal.

Le microscope confocal permet de visualiser un plan de coupes particulier de l’objet visé grâce à l’utilisation d’un laser qui va « éclairer » les éléments de l’objet à analyser. [Shinya Inoué Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy dans Handbook of biological Confocal Microscopy 1-14]

Le laser illumine une zone de faible dimension sur l’objet puis grâce à un faible décalage de l’angle de visée la zone suivante est éclairée. La limite de résolution, c’est à dire l’écart entre chaque zone éclairée, est fonction de la longueur d’onde du laser comme cela a été établi par la relation d’Abbe. Le signal de retour qui est projeté sur une matrice photosensible permet de construire l’image de l’objet analysé dans un plan de coupes délimité.

Ce processus est réitéré en résolution axiale afin d’obtenir une série de coupes que l’on pourra ensuite analyser. [John K Stevens Introduction to Confocal Three-Dimensionnal Volume Investigation pages 3-27]

Eclairage de l’échantillon

Il n’est possible d’extraire des informations sur l’échantillon biologique à la seule condition qu’il réagisse de manière spécifique au signal excitateur. Pour cela il est nécessaire que l’échantillon ait des caractéristiques physico-chimiques qui permettent de le caractériser. On peut par exemple utiliser les propriétés d’excitabilité du Bromure d’éthidium (Bet) qui va, en recevant un rayon lumineux dans l’U.V., passer à un état excité, puis renvoyer un signal lumineux de longueur d’onde plus faible qui permettra de le mettre en évidence.

En traitant une culture cellulaire au Bet, composé chimique ayant une forte affinité pour la double hélice d’ADN, on va pouvoir mettre en évidence la quantité d’ADN présente. On soumet l’échantillon au rayon laser du microscope, et on recueille le signal réémis par l’échantillon à chaque étape d’excitation. [Hayes et al 1995 Ploidy analysis on Wilms’ tumour touch imprints using ethidium bromide and automated image analysis integrated confocal laser scanning microscopy. Virchows Arch, 427,101-104]

Caractéristique des fluorochromes

L'acquisition des données grâce à la fluorescence émise par l'échantillon biologique doit se faire en évitant au maximum de modifier l’ échantillon par une illumination trop intense.

L'état de visualisation de l'échantillon dépend en effet de la stabilité chimique des composants fluorescents. Ces composants sont des molécules capables de réagir à l'excitation en renvoyant un signal de nature lumineuse.

En fonction de l’intensité du laser, des modifications chimiques peuvent apparaitre dans le volume atteint par le rayon laser.

Les optiques du microscope focalisent le rayon dans une région de faible volume, et de manière graduelle, les composés biologiques de cette région vont être modifiés en fonction de l'intensité de l'excitation lumineuse et de leur propre environnement chimique.

Lorsque une zone de l'objet a été excitée, l'excitation laser est dirigée sur le pixel suivant. Le nouveau flux photonique est espacé d'une distance correspondant à la variation de l'angle de visée du microscope. En fonction de l'espacement et du temps entre chaque visée, les modifications chimiques des composés de l'objet biologique situées au proche voisinage du faisceau laser sont variables. [Gandin et al 1983 Quantum yields of singlet oxygen production by xanthenes derivatives Photochem Photobiol, 37, 271-278]

L'accumulation d’énergie lumineuse lors de chaque étape d'excitation va provoquer de proche en proche une perte des propriétés de fluorescence des molécules marqueurs. Ainsi un parcours réédité plusieurs fois d'une zone de l'objet biologique va favoriser la disparition du signal et le phénomène de blanchiment appelé fading. [Lewis et al 1941 Reversible photochemical processes in rigid media. A study of the phosphorescent state. J Am Chem Soc 63, 3005-3011] [Tsien & al Fluorophores for Confocal Microscopy : Photophysics and Photochemistry ] [Handbook of Biological Confocal Microscopy Chapter 16 169-177]

Chaque fluorochrome a ses propres caractéristiques de résistances chimiques à l'excitation et sera susceptible en fonction des paramètres physico-chimiques environnementaux d'émettre une certaine quantité de photons en réponse avant de perdre sa capacité d'excitabilité. [Mathies & Stryer, 1986 Single molecule fluorescence detection : a feasability study using phycoerythrin. Application of fluorescence in the Biomedical Sciences AR Liss 129-140]

Pour éviter au maximum ces phénomènes de désactivation, il a été mis au point des techniques visant à protéger les fluorochromes des réactions d'oxydation en utilisants des antioxydants naturels ou de synthèses qui sont choisis en fonction de l'adéquation entre leur propriété et l'observation réalisée. Notamment lors d'observations in vivo des objets biologiques, on évite d'utiliser certains antioxydants trop actifs en chassant les molécules d'oxygènes par des gaz inertes comme l'azote. [White & Stryer (1987) Photostability studies of phycobiliprotein fluorescent labels Analytical Biochemical 161, 442-452]

Par ailleurs il a été prouvé qu'on obtenait un optimum du signal pour des concentrations données de fluorochromes sur les molécules marqueurs proprement dites.[ Watt & Voss (1977) Mechanism of quenching of fluorescein by anti-fluorescein IgG antibodies Immunochemistry 14, 533-541]

Emission du signal :

On distingue deux types de signaux : les signaux non absorbés par l’échantillon : lumière réfléchie, transmise et réfractée.et la lumière réémise par les molécules fluorescentes [Cheng & al Image Contrast in Confocal Light Microscopy Handbook of biological confocal microscopy 179-195]

Le signal réémit n’est plus une lumière cohérente comme le laser et peut suivre des directions variées.

Les rayons lumineux issus de l’échantillon qui sont captés par les optiques du microscope vont ensuite suivre un trajet qui leur est propre à l’intérieur de l’ensemble des optiques du microscope jusqu’au détecteur. En détection de fluorescence le rayon émit suit le chemin inverse du rayon d’excitation. Pour le rediriger vers le photomultiplicateur qui va enregistrer le signal émit, on interpose un miroir dichroïque qui va diriger le signal de retour vers le système d’analyse du microscope. Seulement 5 à 10 % du signal initial émis par le fluorophore sera recueilli par le photomultiplicateur, du fait des étapes de filtrage et des imperfections optiques propre à ce matériel.

Afin de pouvoir caractériser le signal de retour on effectue un filtrage qui est propre au spectre d’émission de la molécule marqueur. En cas d’émission endogène d’un signal sous l’effet de l’excitation, on va pouvoir filtrer les bandes passantes en interposant un appareillage optique assurant la réflection des longueurs d’onde non désirées afin de déterminer quel est le signal le plus intérressant.

Il est ainsi possible de faire simultanément une analyse de plusieurs longueurs d’ondes a condition de disposer d’autant de détecteurs que de bandes passantes différentes.

Réception du signal

Toute luminosité externe lors de l’utilisation du microscope est à proscrire car elle s’ajoute au signal lumineux succeptible d’être renvoyé par l’objet.

De plus aussi précis que puisse être la focalisation du laser en un point, la déperdition du signal autour de ce point de focalisation, entraîne la réception de lumière hors champs. Cette lumière hors champs donne du flou à l’image, il est cependant possible de filtrer cette composante hors focus du signal en adaptant sur le trajet lumineux avant le photomultiplicateur un diaphragme sténopéique qui va empêcher la réception de signal hors focus. [Size and Shape of the confocal spot : control and relation to 3D imaging and image processing. Handbook of Biological Confocal Microscopy James B. Pawley (First Edition), 87-91]

En pratique le capteur CCD enregistre une image sous forme de charges par pixel. Chaque pixel emmagasine une charge d’électrons proportionnelle à l’intensité de la lumière incidente. Les charges sont ensuite dirigées vers une sortie afin d’être amplifiées et digitalisées : c’est ce que l’on appelle le transfert de charges. Pour avoir une bonne sensibilité de la caméra, il faut pouvoir disposer d’un bon niveau d’amplification avec une dynamique de valeurs par pixels importantes afin de pouvoir distinguer les différentes intensités lumineuses.

Cette dynamique implique bien sûr un nombre de bits accordés par pixel plus important. Pour pouvoir ensuite faire l’analyse de l’image il faut tenir compte autant de la quantité d’informations que du format des données.

Développements

Les points qui importent dans l’analyse de l’échantillon sont la netteté de l’image et la capacité de l’échantillon à résister aux agressions du laser afin de pouvoir par exemple permettre une étude in vivo du matériel biologique.

Une nouvelle technique qui permet de satisfaire ces critères de pérennité de l’échantillon est l'utilisation de plusieurs longueurs d'ondes qui vont stimuler le même fluorophore mais avec une intensité globale plus faible. On parle ainsi d'excitations deux photons et trois photons. Les rayons excitateurs de longueurs d'ondes plus importantes que la longueur d'onde utilisée généralement, et donc d’énergie plus faible vont simultanément être focalisés sur la même portion de l'échantillon afin d'exciter les fluorophores spécifiques. Ceux-ci qui répondre par une émission photonique qui correspond à la sommation du signal excitateur des deux longueurs d'ondes initiales. [Denk et al 1990 Two-photon laser scanning fluorescence microscopy Science, 248(4951), 73-6]

On utilise ainsi une intensité de signal initial beaucoup plus faible qui se traduit notamment par une forte décroissance de la dispersion énergétique du rayon initial autour du point visé. En utilisant deux rayons excitateurs on obtient une probabilité d'excitation proportionnelle au carré de l'excitation d’un seul rayon. On peut donc se permettre d'utiliser des intensités de rayons excitateurs plus faibles qui permettront d'éviter les phénomènes de photobleaching.

De même on évite en grande part la lumière hors focus et il n'est plus nécessaire d'utiliser de diaphragme sténopéique pour éviter le signal hors focus.

Traitement du signal

Le signal qui a été enregistré sur la matrice puis qui est ensuite stocké sur un support informatique est traité par différentes techniques.

Il y a d'abord utilisation d'algorithme de débruitage qui vont permettre d'enlever le signal parasite qui est fonction des conditions expérimentales. Ces techniques sont complexes et font appel à des algorithmes de déconvolution qui impliquent de modéliser le bruit ajouté à l’objet. [Van der Voort & al 1995 Restoration of confocal images for quantitative image analysis. Journal of Microscopy, 178, 165-181].

Le volume obtenu va ensuite être traité sous forme de voxel, à chacun de ces éléments de volume de l'image est associé l'intensité recueillie par le photomultiplicateur du microscope.

Le volume obtenu peut ensuite être traité par un filtre 3D qui permet d'ajuster les variations qui peuvent se présenter sur l'ensemble des stacks. Le type de filtrage utilisé doit être adapté en fonction de l’espacement entre les coupes.

Ensuite en fonction des informations que l'on cherche à obtenir, on peut procéder à un seuillage en niveau de gris de l'ensemble des voxels afin de mettre en évidence les différents objets présents dans l'image. [Baumann & al 1992 Three-Dimensional Component Labeling of Digital Confocal Microscope Images Enumerates Replication Centers in BrdUrd Labeled Fibroblasts Cytometry, 13, 220-229]- [Routine d’étiquettages de taches recursif 3D du projet KUIM de l’université du Kansas J. GAUCH]- [Hakan Ancin & al 1996 Advances in Automated 3-D Image Analysis of Cell Populations Imaged By Confocal Microscopy Cytometry, 25, 221-234]

Ce type de seuillage peut être fait de manière manuelle interactive, mais il existe aussi des techniques de seuillage automatique.

On peut aussi utiliser la technique de Voronoï de création d'objets. [Application of confocal laser microscopy and three-dimensional Voronoï diagrams for volume and surface estimates of interphase chromosomes. Journal of Microscopy, 177,150-161] cette technique permet d’identifier un objet dès qu'un critère d’homogénéité est atteint sur une région donnée.

Les différents objets ainsi identifiés vont pouvoir être traités de différentes manières afin de mettre en évidence les paramètres statistiques caractérisant les objets sur l'ensemble des images.

Guillaume FAGOT